新鲜出炉年09期自体

摘要

目的

探讨自体软骨细胞结合Ⅰ型胶原蛋白三维支架治疗膝关节软骨损伤的近期疗效。

方法

回顾性分析年1月至年3月采用自体软骨细胞结合Ⅰ型胶原三维支架移植治疗膝关节软骨缺损患者共9例（9膝），男6例，女3例；年龄18~41岁，平均（30±7.8）岁。软骨缺损位于股骨髁4例、股骨滑车4例、髌骨1例，缺损面积2.5~10cm2，平均（4.9±2.1）cm2。一期手术关节镜下在膝关节股骨髁非负重区获取全层软骨，约0.5cm×1.0cm，进行软骨细胞培养和体外扩增8~14d；二期手术采用冻干人纤维蛋白胶将载有软骨细胞的冻胶原移植物黏附于缺损部位。术后进行严格的康复训练。术前及术后3、6、12个月进行国际膝关节文献委员会（InternationalKneeDocumentationCommittee，IKDC）评分、Lysh?lm主观膝关节评分，术后3天内、1、3、6及12个月进行膝关节MR检查及软骨修复组织的核磁共振评分（magneticresonanceobservationofcartilagerepairtissue,MOCART）。

结果

9例患者均获得临床随访，术前IKDC评分为（52.7±6.9）分，术后3、6、12个月分别为（71.1±6.6）分、（83.3±2.9）分和（92.0±3.6）分，差异有统计学意义；术前Lysh?lm评分为（55.8±8.7）分，术后3、6、12个月分别为（74.8±7.0）分、（84.8±4.8）分和（93.1±5.7）分，差异有统计学意义。8例患者获得MRI随访，术后3天内、1、3、6及12个月MOCART评分为（43.6±6.0）分、（47.8±5.8）分、（57.8±5.8）分、（64.3±4.8）分和（72.1±4.9）分，差异有统计学意义；术后12个月，T2Mapping定量测量示移植物T2值为（48.7±3.2）ms，与正常区域对照差异无统计学意义。

结论

自体软骨细胞结合Ⅰ型胶原蛋白三维支架治疗膝关节软骨损伤近期疗效满意。

膝关节软骨损伤是膝关节外科和运动创伤领域的常见病，其发生率为60%~66%，其中Ⅳ度损伤占11%[1,2,3,4]，由于软骨细胞自身生长和修复能力有限，临床治疗效果往往不尽满意。常见的治疗方法包括关节镜下磨削成形术、软骨下钻孔术、微骨折术等骨髓刺激技术。多数研究表明采用上述修复方法形成的新组织多为纤维软骨，其机械性能和生物学性能与透明软骨存在较大差距[5]。

自体软骨细胞移植（autologouschondrocyteimplantation，ACI）是将自体软骨细胞经培养扩增后移植到全层软骨缺损区域的技术，至今已经发展至第四代，文献报道临床疗效满意[6,7]。但传统骨膜或胶原膜覆盖的ACI技术是将培养扩增的软骨细胞悬液回植于软骨缺损处，可能造成细胞流失或分布不均。经单层或双层夹心细胞培养的基质诱导自体软骨细胞移植（Matrix-inducedautologouschondrocyteimplantation，MACI）技术将软骨细胞种植于胶原膜上，但细胞排列及分化方向与生理软骨并不一致。内置支架ACI通过对细胞进行三维多层培养，将不同生长时期的细胞置于三维支架中不同位置，保证新生细胞的形态、功能和分化方向稳定[8]。内置支架在体内可被降解，同时支架内的软骨细胞会分泌形成Ⅱ型胶原蛋白，即透明软骨的细胞基质，从而达到修复软骨的目的。手术操作中，内置支架的ACI将软骨细胞结合在三维支架上，克服了早期ACI细胞流失和分布不均的缺点；其次，移植物通过生物蛋白胶直接黏附于软骨缺损区，无需缝合，对周围的健康软骨无损伤且操作简便。

Ⅰ型胶原蛋白可作为内置三维支架结合自体软骨细胞进行软骨修复，是最新的软骨修复技术之一，组织学研究表明可达到接近正常透明软骨的修复效果[9,10]。回顾性分析我院采用自体软骨细胞结合Ⅰ型胶原蛋白三维支架（Cartilageregenerationsystem，CaReS，德国）治疗膝关节软骨损伤患者9例（9膝），目的在于：（1）评估CaReS治疗膝关节软骨缺损的技术特点和近期疗效；（2）评价软骨移植物的评估方法；（3）探讨影响ACI手术效果的因素。

资料与方法

一、纳入和排除标准

术前通过MRI对软骨缺损进行初步诊断，并在膝关节镜下探查确诊并测量缺损大小。

纳入标准：（1）软骨缺损面积2.5~10cm2；（2）对侧关节软骨损伤不超过国际软骨修复学会（Internationalcartilagerepairsociety,ICRS）分级Ⅱ级；（3）患侧至少2/3半月板完整，韧带完整（如有损伤则需重建），髌骨轨迹正常（如有异常则应矫正），下肢力线正常（如偏离4°则应矫正），关节活动度正常；（4）身高体重指数（bodymassindex，BMI）30kg/m2，年龄18~50岁。

排除标准：关节强直，关节纤维化，关节感染，系统性疾病，传染性病毒感染，肥胖。

二、一般资料

本研究经本单位伦理委员会批准，回顾性研究年1月至年5月我科连续收治并采用CaReS（图1）移植治疗膝关节软骨缺损患者共9例，男6例，女3例；接受手术时患者年龄为18~41岁，平均（30±7.8）岁；术前病程为4天~个月，平均（74±）个月；术前BMI为19.3~26.4kg/m2，平均（23.5±4.8）kg/m2。

图1

自体软骨细胞结合Ⅰ型胶原三维支架实物图

三、软骨损伤分级

采用ICRS分级方法：Ⅰ级为软骨软化或浅表软骨开裂；Ⅱ级为较深层软骨损伤，损伤深度软骨厚度的50%；Ⅲ级为深层软骨损伤，损伤损伤深度软骨厚度的50%，尚未累及软骨下骨；Ⅳ级为全层软骨损伤，软骨下骨裸露。

四、手术方法

（一）获取关节软骨组织

采用腰硬联合麻醉，患者取仰卧位，患肢给予气囊止血带，常规采用前内侧、前外侧入路行膝关节镜检查评估软骨损伤的部位、大小和深度（表1），在距离滑膜缘5mm的股骨内髁或外髁非负重区获取全层软骨，大小约0.5cm×1.0cm。如有半月板、前十字韧带损伤，分别予以修复、成形或重建。术后8h内抽取患者肘正中静脉血约80ml提取血清，用于软骨细胞培养。

表1

9例患者的一般情况和患侧软骨损伤情况

（二）软骨细胞培养

将取下的软骨组织送至关节动力安达生物科技有限公司（中国）进行细胞分离培养：（1）软骨组织在37℃下进行刨削、切割（20±4）h，分离软骨细胞，细胞计数为合格。（2）用自体全血血清制备的自体凝胶中性培养基，将软骨细胞加入培养基。（3）加入自鼠尾提取纯化的Ⅰ型胶原（中国食品药品检定研究院免疫源性检测报告编号：QZ），于37℃环境中混合培养，每3~4d更换培养基。（4）培养8~14d后，检测细胞活性与计数、理化性能、Ⅱ型胶原表达及微生物含量（中国药品生物制品检定所合格证编号：中检动函[]），检验合格后于术前1d医院。

（三）软骨细胞移植

采用腰硬联合麻醉，患者取仰卧位，患肢给予气囊止血带。对股骨内髁或股骨滑车损伤，经髌骨内侧作长约6cm直切口；对股骨外髁损伤，经髌骨外侧作长约6cm直切口；对髌骨损伤，作膝前正中长约10cm直切口。切开关节囊进入关节，暴露软骨损伤部位，用尖刀沿软骨损伤边缘垂直切割至软骨下骨，用刮匙清创病损软骨下骨组织，根据软骨缺损区的大小和深度，修整载有软骨细胞的冻胶原移植物准备移植，用冻干人纤维蛋白胶均匀注射于软骨缺损区（图2A），将移植物黏附于缺损部位，失水约25min至移植物高度与周围健康软骨齐平（图2B），轻柔活动膝关节数次，确定移植物无移位后逐层缝合切口。如有髌骨轨迹不良，应予以矫正。

图2

软骨细胞移植手术示意图A刮匙清创软骨损伤部位后，用冻干人纤维蛋白胶均匀注射于软骨缺损区B将修整好的移植物植入软骨缺损区

（四）术后处理

术后常规使用一代头孢类抗生素1d，预防术后感染，使用非甾体类抗炎药常规镇痛。术后进行持续被动运动训练（continuouspassivemotion，CPM），渐进式调节关节活动范围（rangeofmotion，ROM）及负重（表2）。

表2

膝关节软骨移植术后康复计划简表

四、术后随访及疗效评价标准

术后3、6、12个月进行随访，术前和术后3天内、1、3、6、12个月行膝关节MR检查。采用国际膝关节文献委员会（InternationalKneeDocumentationCommittee，IKDC）评分评价疼痛、最大活动能力及日常生活能力等，满分为分，评分90分为正常，80~90分为接近正常，70~80分为异常，70分为显著异常。采用Lysh?lm主观膝关节评分从疼痛、肿胀、跛行、交锁、行走不稳、下蹲、上下楼等方面评估膝关节功能，满分为分，评分87分为优，77~86分为良，67~76分为中，66分为差。

采用软骨修复组织的核磁共振评分（magneticresonanceobservationofcartilagerepairtissue,MOCART）评估软骨形态[11]，该评分从软骨缺损的修复程度、移植物于周围软骨的整合情况、移植物表面、移植物深层、移植物信号、软骨下致密骨、软骨下骨、关节粘连、滑膜炎等8个方面评价术后膝关节及软骨移植物的形态改变，满分为分。在T2Mapping的伪彩图上，对照矢状位三维双回波稳态（3dimensionaldualechosteadystate,3D-DESS）序列的T2WI成像，描绘感兴趣区软骨边界，选择感兴趣区显示最好的层面重复测量3次并取T2平均值（ms），正常区对照选择移植物旁5mm内、矢状位3D-DESS序列T2WI成像上显示表面完整、内部信号无异常的软骨。

五、统计学处理

采用SPSS22.0统计软件（IBM公司，美国）进行统计学处理。采用重复测量数据的方差分析比较手术前后不同时点的IKDC、Lysh?lm及MOCART评分，采用Bonferroni法对不同时点评分进行两两比较；采用配对t检验比较手术后不同时点移植物与周围正常软骨T2值。检验水准α值取双侧0.05。

结果

一、手术结果

所有患者手术均顺利完成，术后无感染等并发症。

二、疗效评价

术前患者IKDC评分与术后3个月、6个月、1年相比呈逐渐升高趋势，两两比较差异均有统计学意义（P0.05）。

术前患者Lysh?lm评分与术后3、6、12个月相比呈逐渐升高趋势，除术后3个月与6个月评分差异无统计学意义外（P0.05），其余两两比较差异均有统计学意义（P0.05，表3）。

表3

手术前后患者膝关节临床评分的变化情况（±s，分，9例）

除9号患者外（患者因行胫骨结节内固定术，未行MR检查），所有患者均于术后3天内、术后1、3、6、12个月行MR检查。MOCART评分随时间推移呈逐渐增高趋势（表4），差异有统计学意义（P0.05）；术后3天内与术后1年、术后1个月与术后1年评分的差异有统计学意义（P0.05）。其中软骨缺损的修复程度、移植物与周围的融合程度、移植物的表面结构、软骨下致密骨的完整性、软骨下骨的完整性在术后各时点的差异无统计学意义（P0.05），移植物深层结构、移植物信号强度、关节粘连和关节滑膜炎方面的评分在术后呈逐渐增高的趋势，结果有统计学意义（P0.05）；移植物深层结构方面，术后1个月与术后1年评分差异有统计学意义（P0.05）；移植物信号强度方面，术后3天内与术后1年评分差异有统计学意义（P0.05）；关节滑膜炎方面，术后3天内与术后1年、术后1个月与术后1年评分的差异有统计学意义（P0.05，表4，图3）。

表4

MRI随访的8例患者术后MOCART评分及各指标的变化情况（±s，分，8例）

图3

男（4号），30岁，左膝前十字韧带断裂、股骨滑车软骨损伤，一期行前十字韧带重建，二期行股骨滑车软骨细胞移植术，MRI矢状位3D-DESS序列T2WI成像变化情况，箭头所示为移植软骨A术后3天，移植物呈高信号，表面光滑并与周围软骨相平，无裂隙，关节内滑膜水肿，关节积液B术后3个月，移植物信号较前减低，但内部信号不均，关节积液较前减少，滑膜水肿、炎症较前加重C术后6个月，移植物信号较前减低但仍高于周围软骨，内部信号的均一性较前改善，滑膜水肿、炎症较前明显改善D术后12个月，移植物同周围软骨趋于等信号，滑膜水肿、关节积液基本消失

T2Mapping伪彩图可见术后早期软骨移植物内部信号混杂、色阶增高，但随着时间的推移，移植物内部色阶逐渐降低、信号趋于稳定。定量分析结果显示移植物在术后3天内、1、3、6个月移植物与对照的差异有统计学意义（P0.05），术后12个月时移植物与对照的差异无统计学意义（P0.05）。纵向对比提示随时间的推移，移植物T2值变化的差异有统计学意义（F=72.，P=0.），正常区软骨的T2值较为稳定（F=0.，P=0.，表5，图4，图5）。

表5

术后不同时点软骨移植物MRIT2值测量结果（±s，ms，8例）

图4

男（4号），30岁，术后MRIT2Mapping伪彩图变化，箭头所示为移植软骨A术后3天内可见软骨移植物内部信号混杂，色阶增高B术后3个月，移植物信号不均，表面及深层可见色阶增高C术后6个月，移植物内部信号均一性较前改善，色阶较前降低D术后12个月，移植物内部信号趋向稳定，色阶进一步降低、但仍略高于周围正常软骨

图5

软骨移植物MRIT2值的变化情况随时间推移，软骨移植物T2值与股骨软骨对照趋于相近，并成逐渐下降趋势

三、并发症及处理

2例患者（2，3号）分别于术后6个月及12个月复查MR时发现移植物增生、肥厚，但患者均无明显不适症状，因此未行特殊治疗。

1例患者（6号）术后4个月膝关节活动度部分丢失（0°-90°），考虑与术后膝关节局部粘连有关，经CPM训练和微波治疗6周后膝关节活动度恢复正常。

讨论

一、CaReS治疗膝关节软骨缺损的技术特点与注意事项

CaReS治疗膝关节软骨缺损的手术操作简便。在软骨细胞移植手术中，一般在髌旁作长约6cm手术切口进入关节，结合膝关节不同角度的屈曲即可显露病变。其次，移植物通过生物蛋白胶直接黏附于病变部位，克服了以往需要将骨膜或胶原缝合于周围软骨的缺点。

采用本方法术后并发症少见，包括移植物肥厚（0~6.3%）、移植物分层或脱落（2%~5%）、关节粘连（1%）、感染（1%）等[6]。移植物肥厚发生率最高，患者多表现为关节僵硬，症状严重者往往需要再次手术对肥厚的移植物进行刨削、成形，但发生机制不明。本组病例中2例患者分别在术后6个月、12个月MR检查时发现，患者无明显不适，故未行特殊治疗。文献报道移植物分层或脱落亦偶有发生，原因可能为移植物内软骨细胞与周围软骨结合不良，与术后再次受伤有关，本组患者未出现此症。

合理的康复方案是软骨损伤治疗的重要组成部分。术后早期移植物较软，同周围组织结合并不十分紧密，容易受到压力和剪切力的破坏，康复应以被动活动、控制负重为主；中期患者可逐步过渡到完全负重，并进行闭链力量训练；到后期（术后12周起）则应逐步恢复日常活动，进一步加强肌肉力量和本体感觉的恢复训练[12]。Niethammer等[13]指出过早让患者恢复体育运动对长期疗效不利，认为术后1年开始恢复体育运动更佳。

二、软骨移植的评价方法

软骨移植术后随访的评估方法有很多。临床症状和体征是最基本的考察指标。Schneider等[9]一项多中心研究对例接受CaReS治疗的病例进行1~5年随访，采用IKDC评分、疼痛视觉模拟评分（Visualanaloguescale，VAS）和SF-36评分作为评价指标，优良率为80%~88%。本研究9例患者，手术过程顺利，术后IKDC评分及Lysh?lm评分逐步提高，提示膝关节功能逐步改善。

MR检查是目前评价软骨损伤和修复的常用方法。T2mapping是关节软骨MRI生化成像的主要序列，通过T2值反映软骨内胶原的含量、构象及含水量的变化[11]。软骨移植术后早期，胶原纤维排列杂乱以及手术造成表面软骨水肿、关节液渗入是T2值较高的主要原因。Zheng等[14]研究MACI术后软骨组织的生化特性，发现术后48h移植物内并无确切软骨基质形成，但在术后21d出现软骨样基质，术后6个月透明样软骨组织含量占75%。Trattnig等[15]利用T2Mapping技术定量测定软骨细胞移植术后患者不同时期移植区T2值，术后早期（3~13个月）移植区T2值高于周围正常软骨，长期随访组（19~42个月）移植区T2值接近正常关节软骨。本研究中，术后各时点MOCART评分变化的差异有统计学意义。移植物深层结构、移植物信号强度、关节粘连和关节滑膜炎在术后各时点的差异有统计学意义，提示移植物的结构变化是影响MOCART评分的主要因素。与正常软骨相比，移植物的T2值随时间推移逐渐下降，术后1年移植物T2值与周围软骨差异无统计学意义。提示随着时间的推移，移植物内Ⅱ型胶原蛋白以及自由水的含量趋向正常并逐渐形成透明软骨样的修复组织，同时移植物不断塑形、改建，结构均一性及其与周围软骨融合情况良好。

二次关节镜探查能直接观察移植软骨的形态，同时可以取活组织检查，但由于大多患者临床功能恢复良好，不具备关节镜探查的指征，限制了该方法的应用。

三、自体软骨移植技术手术效果的影响因素

膝关节软骨损伤常合并其他运动损伤。膝关节前十字韧带损伤、半月板损伤及髌股关节发育不良会增加膝关节软骨损伤的发生率。膝关节的力线异常是膝骨关节炎发生的重要原因。Minas等[16]指出通过高位胫骨截骨矫正膝关节异常力线，15年优良率为88%，优于对照组的66%。Handerson和Lavigne[17]指出ACI同时进行髌骨力线重排能获得更优的临床功能。本研究纳入的9例患者中，3例合并前十字韧带断裂，3例合并半月板损伤，1例合并髌股关节发育不良，患者术后临床功能均得到改善，提示恰当地处理合并韧带及半月板损伤、矫正不良力线是保障软骨移植手术效果的前提。

本研究中，软骨缺损面积大于4cm2者5例、小于4cm2者4例，均获得了满意的临床效果。Nawaz等[18]一项样本量平均随访6.7年的生存分析指出，损伤面积大小对软骨移植物的中长期优良率无明显影响，可能与骨髓基质干细胞呈垂直长入胶原支架有关。

软骨损伤部位是手术优良率和移植成功率的重要影响因素，Peterson等[19]指出髌骨软骨缺损以及多处软骨损伤术后患者优良率较低，Nawaz等[18]的研究表明股骨内髁、髌骨以及多处软骨缺损的病例失败率高于股骨外髁与股骨滑车。

软骨损伤程度对ACI效果有重要影响，软骨移植物在体内的长入、塑形和改建与软骨下骨骨髓基质干细胞的分化有关，年龄或病程增长造成关节退变程度加重，甚至出现局部软骨下骨硬化，影响骨髓基质干细胞的修复能力。有学者指出年轻患者、术前良好的膝关节功能、较短的病程与术后优良率相关[20]。Nawaz等[18]和Krishnan等[20]指出术前接受骨髓刺激技术（如微骨折术）治疗的患者术后失败率较高。

四、本研究的局限性

CaReS治疗费用昂贵，本研究样本量较少，对CaReS治疗膝关节软骨损伤的临床效果、影响因素的初步总结还有待进一步探讨。尽管随访MRI片提示移植物生长情况良好，但缺少二次关节镜探查和组织学证据。

综上所述，CaReS治疗膝关节软骨损伤，术后临床及影像学随访结果良好，无不良事件，移植物生长情况良好，是安全、有效的治疗方法，可作为治疗较大面积软骨损伤的优先选择，也是未来的发展方向之一。

参考文献

[1]

Ar?enA,L?kenS,HeirS,etal.Articularcartilagelesionsinconsecutivekneearthroscopies[J].AmJSportsMed,,32(1):–.

[2]

CurlWW,KromeJ,GordonES,etal.Cartilageinjuries:Areviewof31,kneearthroscopies[J].Arthroscopy,,13(4):–.

[3]

HjelleK,SolheimE,StrandT,etal.Articularcartilagedefectsin1,kneearthroscopies[J].Arthroscopy,,18(7):–.

[4]

WiduchowskiW,WiduchowskiJ,TrzaskaT.Articularcartilagedefects:Studyof25,kneearthroscopies[J].Knee,,14(3):–.

[5]

GoyalD,KeyhaniS,LeeEH,etal.Evidence-basedstatusofmicrofracturetechnique:asystematicreviewoflevelIandIIstudies[J].Arthroscopy,,29(9):–.

[6]

HarrisJD,SistonRA,BrophyRH,etal.Failures,re-operation,and